PCR untuk mengamplifikasi exon 13 gena RET

amplifikasi gena dengan PCR menurut metode Ceccherini et al, 1994
primer forward: 5'-CTC TCT GTC TGA ACT TGG GC-3'
primer reverse: 5'-TCA CCC TGC AGC TGG CCT TA-3'
menghasilkan PCR product sepanjgan 238 basepair

Reaction mix:
1. PCR buffer 10 x : 2,5 uL
2. MgCl2 50 mM : 0,5 uL
3. dNTPs 25 mM : 0,2 uL
4. Tag Pol 5 u/uL : 0,2 uL
5. Primer Forward: 1 uL
6. Primer Reverse: 1 uL
7. DNA template: 1 uL
8. dH2O : 18,6 uL
Total: 25 uL

atau dengan 2x PCR master mix
1. PCR master mix: 15 uL
2. Primer Forward: 1 uL
3. Primer Reverse: 1 uL
4. DNA template: 2 uL
5. dH2O : 11 uL
Total: 30 uL

2x PCR mix terdiri dari
1. Taq polymerase 50 unit/ml
2. 2 x PCR buffer
3. dNTPs 200 uM
4. MgCl2 3 mM

PCR condition

96 derajat celsius : 5'

84 C:  30" 
60 C : 45"
72 C : 1'
sikus 35 x

dilanjutkan
72 C : 5'

15 C: ~

preparasi sebaiknya diatas es


Endonuklease Restriksi
Pemotongan produk PCR dengan enzim endonukleasi restriksi TaqI. Hasil digesti dianalisa dengan elektroforesis menggunakan agar gel agarose dan diwarnai dengan etidium bromide. Hasil elektroforesis adalah : TT tidak terpotong, GG terpotong menjadi 2 fragmen sepanjang 139 bp dan 99 bp, sedangkan TG menjadi 3 fragmen sepanjang 238, 139, dan 99 bp

Reaction mixture:

1. DNA from PCR produk: 4 uL
2. NE buffer 10 x: 1 uL
3. BSA 10 x: 1 uL
4. Enzim Taq I: 0,2 uL
5. dH2O: 3,8 uL
total volume: 10 uL
Incubation 65 C selama 24 jam