Isolasi DNA dari kultur sel
Bahan
1. Buffer lysis
50 mM Tris HCL pH 8
100 mM EDTA
100 mM NaCl
1% SDS
2. TE 1X
10 mM Tris HCl
1 mM EDTA
3. Phenol: CIAA (Phenol Chloroform Isoamil Alkohol) (25:24:1)
Phenol 25 mL
Chloroform 24 mL
Isoamil Alkohol 1 mL
4. Proteinase K 20 mg ml
5. Na acetat 2,5 M pH 5,0
Cara kerja:
1, sel hasil kultur (1x10 pangkat 5 sel) dipanen tambahkan 700uL buffer lisis dalam tabung 1,5 mL vortek sentrifuge 5' --> buang supernatan
2. tambahkan 10 ul proteinase K (20 mg/mL)
3. Inkubasikan 55 C selama 2 jam
4. ekstraksi menggunakan fenol-CIAA goyang menggunakan shaker selama 30 menit
5. Sentfrifus kecepatan 12.000 rpm selama 15 menit
6. Supernatan DNA dipindahkan ke tabung 1,5 mL yang baru (hitung volumnya), tambahkan isopropanolol dingin (1:1) atau dengan menambahkan Naacetat 2,5 M pH 5,0 (0,1 x volume supernatan DNA) dan ethanol absolut 2-2,5 kali volume supernatan DNA. bolak balikkan pelan pelan untuk melihat terbentuknya benang DNA
7. apabila benang-bengan DNA tidak tampak, inkubasikan -70 C selama 10 menit kemudian sentrifus 10.000 rpm 10 menit
8. pellet DNA dicuci dengan ethanol 70% selama 500 uL
9. Sentrifus dengan kecepatan 12.000 rpm selama 10 menit
10. buang supernatan , pellet dikeringkan dari sisa ethanol pakai tisu
11 Endapan dilarutkan dengan TE 1x, dengan cara inkubasi pada 50 C selama 30 menit atau diamkan semalam dalam suhu 4 C simpan dalam - 20 C
tujuan sentrifus agar BJ yang berat dibawah ,rinagan diatas
1. Buffer lysis
50 mM Tris HCL pH 8
100 mM EDTA
100 mM NaCl
1% SDS
2. TE 1X
10 mM Tris HCl
1 mM EDTA
3. Phenol: CIAA (Phenol Chloroform Isoamil Alkohol) (25:24:1)
Phenol 25 mL
Chloroform 24 mL
Isoamil Alkohol 1 mL
4. Proteinase K 20 mg ml
5. Na acetat 2,5 M pH 5,0
Cara kerja:
1, sel hasil kultur (1x10 pangkat 5 sel) dipanen tambahkan 700uL buffer lisis dalam tabung 1,5 mL vortek sentrifuge 5' --> buang supernatan
2. tambahkan 10 ul proteinase K (20 mg/mL)
3. Inkubasikan 55 C selama 2 jam
4. ekstraksi menggunakan fenol-CIAA goyang menggunakan shaker selama 30 menit
5. Sentfrifus kecepatan 12.000 rpm selama 15 menit
6. Supernatan DNA dipindahkan ke tabung 1,5 mL yang baru (hitung volumnya), tambahkan isopropanolol dingin (1:1) atau dengan menambahkan Naacetat 2,5 M pH 5,0 (0,1 x volume supernatan DNA) dan ethanol absolut 2-2,5 kali volume supernatan DNA. bolak balikkan pelan pelan untuk melihat terbentuknya benang DNA
7. apabila benang-bengan DNA tidak tampak, inkubasikan -70 C selama 10 menit kemudian sentrifus 10.000 rpm 10 menit
8. pellet DNA dicuci dengan ethanol 70% selama 500 uL
9. Sentrifus dengan kecepatan 12.000 rpm selama 10 menit
10. buang supernatan , pellet dikeringkan dari sisa ethanol pakai tisu
11 Endapan dilarutkan dengan TE 1x, dengan cara inkubasi pada 50 C selama 30 menit atau diamkan semalam dalam suhu 4 C simpan dalam - 20 C
tujuan sentrifus agar BJ yang berat dibawah ,rinagan diatas
Komentar
Posting Komentar